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培养基的制备
1. 硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌氧菌）
酪胨（胰酶水解）15.0 g 氯化钠2.5 g 葡萄糖5.0 g
新配置的0.1%刃天青溶液 1.0 ml L-胱氨酸0.5 g
硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.3ml）0.5 g 琼脂 0.75 g 水1000ml
酵母浸出粉5.0 g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节PH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节PH 值使灭菌后为7.1+0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌 。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。
硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
2. 改良马丁培养基（用于培养真菌）
胨 5.0g 磷酸氢二钾1.0 g 酵母浸出粉 2.0g
硫酸镁 0.5g 葡萄糖 20.0 g 水1000ml
除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节PH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节PH 值使灭菌后为6.4+0.2，分装，灭菌。
改良马丁培养基置23～28℃培养。
3. 选择性培养基
按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂，如聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）等。中和剂或表面活性剂的用量应通过验证。
4. 营养肉汤培养基
胨 10.0g 氯化钠5.0 g 牛肉浸出粉 3.0g 水1000ml
取上述成分混合，微温溶解，调节PH值为弱碱性，煮沸，滤清，调节PH 值使灭菌后为7.2+0.2，分装，灭菌。
5、营养琼脂培养基
按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0 g琼脂，调节PH 值使灭菌后为7.2+0.2，分装，灭菌。
6、改良马丁琼脂培养基
按改良马丁培养基的处方及制法，加入14.0 g琼脂，调节PH 值使灭菌后为6.4+0.2，分装，灭菌。
7、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
取磷酸二氢钾3.65克，磷酸氢二钠7.23克，氯化钠4.30克，蛋白胨1.0克，加水1000毫升，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
供试品的制备
水溶性固体供试品
取本品用灭菌好的研钵研细，取供试品 10g,加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,摇匀,制成1:10均匀供试液.
非水溶性供试品
取供试品5克，加至含溶化的（温度不超过45度）5克司盘80、3克单硬脂酸甘油酯、10克聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45度的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100毫升，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20的供试液。
（1）具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。
①培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml ,每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，记数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计算规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。
细菌、霉菌及酵母菌计数
计数方法的验证
当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证实验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli ）[CMCC(B) 44 102]
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ) [CMCC(B) 63 501]
白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98 003]
菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验的回收率。
（1） 试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
（2） 菌液组 测定所加的试验菌数。
（3） 供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数法测定供试品本底菌数。
（4） 稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。
结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可以与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
检查法
计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
取按验证的方法制备的均匀供试液，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10、1：100、1：1000等稀释级。
1. 平皿法
采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。
取供试液1ml，置直径90㎜的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼指培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼指培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。
培养和计数 除另有规定外，细菌培养，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小时的菌落数报告，霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；必要时，可适当处长培养时间至5～7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板菌数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰细钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。
菌数报告规则 宜选取细菌，酵母菌平均菌落数在30～300之间，霉菌平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。
（1） 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定时，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
（2） 当仅有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落 数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。
（3） 当各稀释级的平均菌落 数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
（4） 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以〈1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
2． 薄膜过滤法
采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器驻滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试品，其滤膜和过滤前先将少量的冲分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或1ml所含菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养或或酵素养浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。
阴性对对照试验 取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。
菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
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农药安全基础知识