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高通量药物筛选采用的筛选方法一般是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分子水平的筛选模型,根据样品与靶点结合的表现,判断化合物的生物活性。在传统的筛选技术基础上,应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等高新技术,建立的一套更适合于药物筛选的技术体系。由于这些筛选方法是在微量条件下进行,同时采用自动化操作系统,可以实现大规模的筛选,因而称为高通量药物筛选。高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系,它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以96孔板、微孔板或芯片形式作为实验工具载体，以自化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，在短时间内能够对数以千、万计的样品进行测试，并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。
分子水平和细胞水平的实验方法[6](或称筛选模型)是实现高通量药物筛选的技术基础。由于高通量药物筛选要求同时处理大量样品,实验体系必须微量化。这些微量化的实验方法有些是应用传统的实验方法加以改进建立的,更多的是根据新的科学研究成果建立的。高通量药物筛选应用的实验方法总体积一般要求在2～250μL,常用的高通量药物筛选模型可以根据其生物学特点分为以下几类:①受体结合分析法。②酶活性测定法。③细胞因子测定法。④细胞活性测定法。⑤代谢物质测定法。⑥基因产物测定法等等。以上这些方法都已经广泛应用于高通量药物筛选中。
自动化操作系统主要是指实验室自动化工作站,俗称药物筛选机器人,是由计算机控制的全自动实验室操作设备。试验室自动化工作站的基本功能是可以自动连续地完成试验的基本操作,如加样:即向每个反应单位(微板中的每一个孔)中加入各种不同成分、不同浓度、不同容积的溶液;稀释:实际上就是加入一定容积的样品或试剂溶液后,再加入一定的溶媒;转移:主要是完成某一试剂或样品的位置变化;混合:将加入的不同溶液进行混合,混合的方式有震荡,也可以用加样器反复吹吸混合;洗板:用适当的溶液清洗试验用的微板,或洗除不需要的反应液;温孵:让反应体系在一定的温度条件下保持一定的时间,使之完成反应过程,自动化工作站可以严格控制温孵的温度和时间;检测:试验室自动化工作站一般都可以与某一种或多种检测仪器连接,在试验操作完成后,可以自动进行必要的检测并自动采集储存数据,完成整个试验过程。快速灵敏的检测仪器采集试验结果数据是高通量药物筛选的特点之一,由于筛选试验是在微量条件下完成的,因此就需要高灵敏度的检测仪器。目前,用于高通量药物筛选的仪器种类很多,其最大的特点是可以对各种不同规格微板中的样品直接进行测定,如同位素放射活性的测定、化学发光测定、生物发光测定、可见光比色、紫外光比色、荧光测定以及电化学测定等等。
实验数据的分析处理系统是高通量筛选的必备条件。由于高通量药物筛选可以在短时间内产生大量数据,对这些数据的采集、储存、分析、处理,必须依靠计算机完成。一般条件下,目前高通量药物筛选使用的检测仪器,基本上都实现了数据采集的自动化,结果检测完毕,试验结果就自动储存在计算机中。数据的分析和处理是专业性很强的工作,要求工作人员不仅具有本专业的基础知识,还需要有较好的数学基础和计算机应用能力。在专业知识的指导下,利用计算机的相关软件,才能够准确快速完成数据的采集、储存、分析、处理。
高通量筛选算法研究是研究如何最合理有效地利用高通量筛选所获得的数据,优化研究过程。有人建立了高通量筛选中标数据的统计学分析系统,该系统用计算模拟的方法,分析中标准确率、假阳性率和假阴性率等。有报道一种以减少高通量筛选工作量为目的的组合库优化策略,称为“遗传式”优化策略。用随机方式先选出第一代有活性的化合物,对其结构特征进行编码(称为“染色体”),然后进行随机修饰(称为“突变”)。再筛选,得到第二代化合物。计算新结构的优度。然后用最优的子代结构替换最差的母代结构。如此重复,逐代优化。有报道另一种利用高通量筛选数据,寻找活性结构的策略。通常的数据分析是将受试化合物按活性大小排序,将超过某一活性水平的确定为中标分子。这种策略当遇到中标率很高或很低的情况,就有困难了。当中标率高时,主要是再次筛选要消耗大量资源,难以选择出有活性的化合物亚类继续追踪。当中标率低时,可供继续追踪的化合物又太少。总之,这种策略不能提供有关在被筛选的化合物中哪些应该继续追踪的信息。关键是在这种方法中,缺少构-效关系模型。有人采用数据开采、递归分类(RPC)的方法,帮助揭示构-效关系,以及帮助确定下一步筛选的化合物类型,RPC是新近出现的一种强有力的分析方法。其核心是寻找能将数据分为较小较均一亚类的统计学上最显著的结构特征。其计算结果表现为构-效关系树,每发现一个“最好的”结构特征,就会新形成一个分枝。同一分枝有相同的结构特点和相近的生物反应性。构-效关系树能帮助分析数据中复杂的构-效关系,并提供统计学上有意义的预测模型,适用于低中标率和高中标率的情况,指导合理选择进一步将筛选的化合物。
样品是高通量药物筛选的物质基础,建立大规模的样品库是重要的内容。样品可以是合成的化合物,也可以是天然产物,而且天然产物具有更重要的作用。同时,高通量药物筛选体系需要相应的数据库支持,保证高通量药物筛选过程中的样品信息、活性数据等得到良好的管理和应用,常用的数据库如“样品数据库”、“筛选样品生物活性数据库”等等。
四、 高通量药物筛选的药物发现过程———反向药理学
反向药理学是相对于传统药理学研究过程,提出的新的研究思路,是对高通量药物筛选引发的研究过程的概括。反向药理学的提出,使人们对以高通量药物筛选为起点的药物研究过程有了更多的理论思考和探索。现代药理学研究的模式是以药物的基本药理作用或药效学作用为基础,应用体内、体外等方法,研究药物作用,达到认识药物作用机制的目的。这种研究模式不仅成功的揭示了大量已知药物的作用机制,而且还发现了大量新现象和作用机制,促进了药理学尤其是分子药理学的发展。同时也促进了生理学、生物化学等基础学科的发展,如受体、离子通道等。反向药理学的最大特点是从药物作用机制开始,研究药物作用的特点和规律。真正促进反向药理学发展的基础是高通量药物筛选的广泛开展。由于高通量药物筛选多数是在分子水平的筛选模型上进行,故获得的药物作用信息是药物与作用靶点之间的关系,或者说是直接认识了药物作用机制。但无论所采用的药物作用靶点属于何种类型,仅根据药物与靶点之间关系,是不能说明药物的全部药理作用。因此,要在药物作用机制的引导下,进行全面的药理学研究,直至整体动物药效学研究。由于该过程与传统药理学研究的模式相反,故称为反向药理学。它与传统药理学研究模式的比较如图1所示。
五、 高通量药物筛选在天然产物中的应用[5]
1、高通量分离技术:主要包括平行分离色谱、序列分离色谱和串联色谱技术。是为了快速获得适合于高通量活性筛选的大量样品而发展起来的自动化高效率色谱分离技术。这些技术能够同时或连续进行:多个样品的快速分离纯化，利用梯度洗脱能够按极性把复杂样品(如中草药提取物)分离成数十个含有不同成分组的部位(或单体)，或通过不同色谱填料的串联使用和自动化控制把一个复杂混合样品分离成一系列高纯度单一化合物。因此，使复杂样品的分离纯化速度得到极大提高，这些成分组部位(或单体)可以直接用于高通量活性筛选，实现天然生物样品的高通量活性筛选，指导活性成分的进一步分离纯化和结构确证。
2、结构鉴定的色谱一波谱联用技术:主要包括液相色谱一质谱、液相色谱一核磁共振联用技术，以上技术可以把混合样品中成分的分离纯化、与结构信息的
获取有机地结合在在一起，同时进行，是复杂混合样品中各成分结构鉴定的高效手段。如果把该技术用于中草药样品活性组分中成分的结构鉴定，不但能够极大地加快中草药中活性成分的结构鉴定速度，而且能够在早期准确赶判断混合样品中的已知成分，遏免重复实验和浪费。
以上两项高新技术与高通量筛选技术有机接合，既可加快以天然生物资源和中草药中活性成分为基础的创亲药物先导物发现速度，也能同步提高中草药药效物质及其作用机制的研究速度，体现中草药研究的现代化。该项研究技术路线见图1
六、 中草药样品的高通量制备、快速结构鉴定技术与高通最活性筛选相结合对创新药物研究的意义
以前，国际上天然创新药物研究的主要方法是通过药理模型(靶点)体外活性跟踪，从包括陆地和海洋生物等的天然资源中，提取、分离、鉴定活性化合物;经结构修饰改造和优化确定出先导物;最后通过全合成、半合成或从天然资源中直接提取解决先导物来源，再进人开发和产业化。近年来，高通量活性筛选技术的引人和迅速发展，极大的推动了创新药物的研究进程。高通量活性筛选的特点是能够进行大量样品的快速筛选，其基本要素包括足够大的样品库和优良的药理模型。与高通量活性筛选相应的样品的高通量制备和样品库以及新型药理模型的建立已成为目前创新药物研究的焦点。随着组合化学热点的降温，适合于高通量活性筛选的天然生物资源提取物、分离部位和单体化合物样品库的建立及相关方法的研究，已成为一些跨国制药企业、农业化学企业与天然产物研究机构合作和竞争的焦点。中草药是具有我国特色的创新药物的重要源泉，由于成分的复杂性，其提取物不宜直接用于高灵敏、微量的高通量活性筛选。但是，如果把平行和序列组合高通量分离技术用于中草药样品的分离，使复杂样品按极性快速分离成一些成分组(或单体)，不仅可以克服以上问题，而且能够使提取物中的微量成分得到富集，与高通量筛选相结合。经过高通量活性筛选得到的活性成分组(或单休)又可以与色谱一波谱联用技术结合，直接快速鉴定其中成分的结构或获取有价值的结构信息指导下一步研究。这样使中草药中创新药物先导物的发现与高通量活性筛选有机地结合，将极大地加快具有我国特色的以中草药有效物质为基础的创新药物研究步伐。
七、 我国药物筛选的特点和任务及其高通量筛选存在的问题
在我国开展药物筛选工作有以下特点:[7]首先是化合物来源广泛且多为天然产物;化合物生物活性的筛选目的较为明确,无目的的合成化合物较少。这是因为我国传统药学为我们提供了一个巨大的资源库,从中药中提取分离筛选新的化合物,有极大的优势。西方发达国家的研究者在对化学合成新化合物感到困难重重的今天,也开始面向天然化合物寻找新药。我们有这样的优势,首先应该把这项工作做好。由于中药已经过了数千年临床应用的检验,根据已有资料可以提供其可能的药理作用信息,也可以减少筛选的盲目性。由于从中药中提取新的化合物劳动强度很大,而且中药理论又主张配伍用药,因此,我国的筛选样品中天然产物的药用部位必然占有一定比例[8]。
应用高通量药物筛选方法发现创新药物,也存在许多尚未解决的问题,如体外模型的筛选结果与整体药理作用的关系,对高通量药物筛选模型的评价标准,筛选模型的新颖性和实用性的统一以及新的药物作用靶点的研究和发现等等,仍然是目前药物筛选领域研究的重要课题。但是,高通量药物筛选的广泛应用,正促进创新药物的发现和研究开发进程。
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