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细菌内毒素标准品为基准物进行标定，确定基重量的相当效价。每1mg工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU，并具备均一性和稳定性的实验数据。效价测定方法如下：每批工作标准品至少取4支样品，使用同一批号鲎试剂、同1支标准品。每支工作标准品按重量、标准品按单位，分别用内毒素检查用水＊稀释制备一系列2倍稀释度的内毒素溶液，与鲎试剂反应，当4支工作标准品的反应终点的对数均值的标准差（S）小于0.365时，计算4支工作标准品的反应终点的几何平均值（以ng/mg表示）及标准品的反应终点值以（以EU／mg表示），按下式计算。
（二）试验准备 本法所用的器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素常用250℃干烤30分钟或180℃干烤2小时，也可用其他适宜方法。试验操作过程应防止微生物的污染。
试验前需核对使用批号鲎试剂的灵敏度标示值，应符合规定。装量加入配带的鲎试剂溶剂。溶解后，为鲎试剂溶液，备用。
供试品的稀释：使用批号鲎试剂的灵敏度标示值小于供试品的内毒限量时，按下式计算，用内毒素检查用水＊将供试剂品稀释后进行检查。
供试品的稀释倍数＝X／λ
X：供试品的内毒素限量内毒素限量（EU／ml）
λ：供试品鲎度剂灵敏度标示值（EU／ml）
(三)检查装有0.1ml鲎试剂溶液的10×75mm试管（或0.1ml／支规格的鲎试剂原安瓿）4支，其中2支加入0.1ml供试品作为试品管，1支加入2λ内毒素工作标准品0.1ml作为阳性对照管，1支加入配带的鲎试剂溶液0.1ml作为阴性对照管。将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。保温过程和拿取试管要小心，避免因受到振动造成阴性结果。
（四）结果判断 将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转1800时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性记录为（＋）凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）。供试品2管如为（一），应认为符合规定，不再进行热原检查法（家兔法）试验。如2管均为（＋），应认为不符合规定。如2管中1管为（＋），1管为（一），按述方法另取4支供试品管复试，4管中有1管为（＋）即认为不符合规定。除正文另有规定外，有符合规定的供试品应再以热原检查法（家兔法）试验，并根据的结果判定。
供试品细菌内毒素的限量应符合各品种正文下的规定。
阳性对照为（一）或阴性对照为（＋），试验无效。
附 灭菌注射用水、注射用水、氯化钠注射液、5％和10％葡萄糖注射液细菌内毒素检查。
【细菌内毒素】取本品，依法检查，供试品细菌内毒素的限量不应超过1EU／ml。如超过1EU／ml，需经热原检查法（家兔法）判定。
鲎试剂标准
本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品。
本品含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原，凝固蛋白原其灵敏度以细菌内毒标准品或工作标准品测定，应为标示量的50％－200％。
（一）性状 本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水生生理盐水中易溶。
（二）鉴别
1．取本品按装量加水溶解后，加茚三酮试液《中国药典1990年版》（二部附录162页）0.25ml，加热煮沸1－2分钟，显蓝色紫色。
2．取本品按装量加水溶解后，再加水适当稀释，照分光光度法《中国药典1990年版》（二部附录24页）测定，在270±1nm的波长处有单一吸收峰。
3．取本品按装量加入内毒检查用水溶解后，吸取0.1ml加入0.1ml细菌内毒素工作标准品或标准品50EU，混匀后，于37℃水浴中放置1小时，有凝胶形成。
（三）检查干燥失重：取本品约0.1在g ，在66℃减压干燥至恒得，减失重量不得过5％（中国药典1990年版二部附录55页）。
自身凝集：取本品4支，按装量加入配带的鲎试剂溶剂，溶解后，分别从每支取0.1ml，再分别加入配带的鲎试剂溶剂0.1ml，混匀后，于37±1℃水浴中放置4小时，不得形成凝胶，若有2管以上形成凝胶，判为不合格；若仅有1管形成凝胶，照同样方法，另取8支重复检查，8支均不得形成凝胶。
缓冲能力：任意取5％、10％葡萄糖注射液，氯化钠注射液无菌注射用水或注射用水适量，加稀盐酸调节pH使供试品溶液pH值为2.90-3.00，取此溶液适量与等量鲎试剂溶解液混匀，重复测定，pH值应为6.00-8.00。
（四）灵敏度测定 预测：
1．取细菌内毒素工作标准品1支，按说明溶解燕稀稀释成1→8等比系列稀释液。
2．取同一批鲎试剂若干支，分别按标示量加入配带的试剂溶剂制成鲎试剂溶液。取10×75mm试管若干支，分别加入0.1 ml鲎试剂溶液，加入内毒素稀释液0.1 ml ，每一稀释液最少作2管，同时作2管阴性对照。轻轻振动上述试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃水浴中。保温60±2分钟观察结果，确定本批鲎试剂灵敏范围，2管阴性对照不得出现阳性结果。
测定：根据预测得到的灵敏范围，将细菌内毒素工作标准品以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个边疆稀释液，每一稀释液作4管，且其最高浓度的4管应均为阳性最低溶液的4管应均为阴性，同上述操作，记录反应结果，计算标准差（s）
X为4组反应终点的数对值,n为4
当s＜0.365时，按下式计算本批鲎试剂灵敏度（λ）
当s＜0.365时测定无效，应检查出现差异原因，并重新测定。
（五）用途 用于细菌内毒素检查。
（六）规格 （1）0.1ml；（2）0.5ml。
（七）贮藏 遮光，在冷处保存。有效期暂定1年。
*系指其内毒素含量不超过0.006EU/ml的注射用水。
鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题
方法：通过对干扰鲎试验准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条件、配制原料等)，提出了鲎试验中应注意的问题。结果：只要克服了检查中的干扰因素，鲎法具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。
鲎试验是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定的一种方法[1]。它具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够全部以鲎法代替家兔热原检查法。但是该法受到许多因素的影响，故在做鲎试验检查时，应注意下列问题。
1鲎试剂本身
1.1鲎试剂灵敏度为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。因为在我们的实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。建议法定部门和生产单位应注意鲎试剂的质量检查。
1.2供试品稀释在取样品时，一定要熟悉中国药典的内容，不能直接取大输液原液0.1ml进行检查，这是排除干扰因素的简单有效的方法。因药典已明确规定试验中鲎试剂的灵敏度不超过0.5EU/ml，根据供试品的稀释公式：供试品稀释倍数=L/λυL：供试品的内毒素限量(1EU/ml)λυ：鲎试剂灵敏度的标示值(EU/ml)故检测大输液均应稀释后才能进行试验，如选用更高灵敏度的鲎试剂，则应增加样品的稀释倍数。稀释用的细菌内毒素检查用水药典作了规定。在4h内不得与鲎试剂产生凝集反应。
如果直接用供试品原液试验，就会使供试品的内毒素提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下，这样，根据目前大输液的生产和贮藏条件，有些就会达不到，鲎法检出的阳性率会提高，兔法复核的机遇也将增多，势必会浪费人力物力。
2操作条件
2.1操作熟练程度操作时严格按无菌操作法进行，安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内及有一个比较整齐的颈口。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确量取。操作时，双手避免在安瓿或试管的上方来回移动，加样后迅速封闭管口，并立即放入恒温水浴箱中，且整个操作过程中时间应紧凑，防止微生物的污染，否则易致假阳性的出现。
2.2混合液的pH值供试液与鲎试剂混合液的pH值对鲎试验的影响较大，根据国内外资料的报道，试验的最适pH为6.25～7.25才能形成最佳凝胶[2]。而药典规定各种葡萄糖注射液的pH为3.2～5.5，我院控制在3.7～42之间。我们曾对pH值小于4.0的多批次葡萄糖注射液作了调pH和不调pH的比较试验，结果发现在该pH范围内两者无显著差异，不调pH者阴性抑制试验仍可得到坚实的凝胶，说明不影响反应灵敏度，且鲎试剂本身具有一定的缓冲能力。但pH值过大或过小均可抑制鲎试剂与细菌内毒素的反应，其原因可能是pH值过大或过小均可破坏极微量的内毒素。
2.3保温温度将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1EU/ml，进行鲎试验，然后分别放置于25、28、31、34、37、40、43、46、49℃水浴保温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升高而加快，但到达49℃保温90min也未出现凝胶。
从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25～40℃之间，随着温度的升高，鲎试剂的灵敏度亦增大，在40～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响，达到49℃或更高温度时，则会破坏鲎试剂。故应严格按照药典的要求，温度控制在(37±1)℃之间，才可获得理想的结果。
2.4保温时间将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释成1EU/ml，进行鲎试验，37℃水浴保温，分别在10、20、30、40、50、70min时观察，发现凝胶形成的坚实状态随着时间的延长而坚固。
从上述实验可以看出，延长保温时间，可以提高鲎试剂的灵敏度，增加假阳性。故应遵守我国药典规定的保温(60±2)min时间。
2.5在鲎试验过程中应防止试管受到振动鲎试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判为阴性。因此，在鲎试验过程中，不宜进行容易引起试管振动的实验操作，试验用的试管架的眼孔直径应与安瓿或试管直径相接近，避免安瓿或试管左右晃动。水浴箱要放置在固定不易受到振动的地方，保温过程中不可随时取出观察。
3其它
3.1配制的原料在鲎试验检测中，0.9%氯化钠注射液多次出现假阳性反应，对此进行了实验工作，查找原因，发现阳性率高与厂家原料有关。笔者把不同厂家生产的氯化钠原料配制的0.9%氯化钠注射液，对不能通过鲎法检查的送药检所用兔法检查，结果为阴性，其中个别厂家的阳性率高于其它厂家，为此将不同厂家的氯化的原料分别在230℃烘焙1h后进行比较，发现个别产品色泽明显变黄。按中国药典1995年版附录规定的易炭化物检查，分别将不同厂家的氯化钠原料进行易炭化物相对照检查，结果上述明显变黄厂家的氯化钠色泽较深。因此认为个别厂家的注射用氯化钠原料含有较多的有机杂质，希望厂家要控制好质量。另外，在葡萄糖原料中偶有存在着β-D聚葡糖的现象，它与鲎试剂发生凝集反应，但注入兔体内不能使其升温，故造成假阳性，所以最好是使用定点厂家合格的葡萄糖原料。
3.2所用器皿均应彻底洗净和灭菌安全实验用器皿均应充分洗涤并冲洗干净，特别是接触酸碱或用洗衣粉、洗液等洗涤后，更应冲洗干净，以免残留物破坏极微量的内毒素。灭菌应按药典中的有关方法处理，防止引入外源性内毒素。如有条件的话可用合格的细菌内毒素快检盒。
3.3阳性对照我国药典规定鲎试验必须做阳性对照，其目的就是证实实验条件下鲎试剂的活性，所以在实验过程中，阳性对照如为阴性，此次试验无效，应重新复做。另外细菌内毒素工作标准品应现用现稀释，不可放置后再用 .
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农药安全基础知识